Un equipo de investigación del Instituto de Biomedicina de Valencia (IBV), perteneciente al Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC), ha logrado secuenciar el genoma completo de la bacteria causante de la tuberculosis a partir de muestras de esputo de pacientes, utilizando técnicas de secuenciación genética. Este avance permite acelerar el diagnóstico de la enfermedad y obtener el perfil genético completo del bacilo de la tuberculosis, brindando, a diferencia de los métodos moleculares convencionales, una información más detallada sobre las posibles resistencias a fármacos y mutaciones. Los resultados de este trabajo, obtenidos con muestras de pacientes en Mozambique y Georgia, se publican en la revista Nature.
El estudio de Mycobacterium tuberculosis (MTB) a partir de muestras clínicas suele requerir una etapa de cultivo para obtener una cantidad suficiente de bacterias, necesaria para llevar a cabo diversas aplicaciones, como los análisis de secuenciación completa del genoma (WGS) de MTB. Como resultado, gran parte del conocimiento que existe hoy en día sobre las características de MTB, como su biología durante la infección, evolución, epidemiología y diagnóstico, proviene en su mayoría de muestras que han sido previamente cultivadas. No obstante, nuevas líneas de investigación abiertas sugieren que el proceso de cultivo podría restringir la diversidad genética de MTB, ya sea al favorecer variantes específicas que se adaptan mejor al crecimiento in vitro, como ocurre con ciertas mutaciones o linajes resistentes a fármacos, o simplemente debido al cuello de botella generado por el inóculo utilizado en el cultivo.
En el caso de que se confirmará dicha hipótesis, esto podría alterar la comprensión de la diversidad bacteriana, especialmente a nivel intrahospedador, e incluso influir en las inferencias epidemiológicas y de resistencia a fármacos, las cuales dependen de la presencia o ausencia de un número limitado de polimorfismos de un solo nucleótido (SNP). La secuenciación directa a partir de muestras clínicas surge como una alternativa, ya que podría evitar las posibles limitaciones asociadas al cultivo. Sin embargo, la implementación de técnicas de secuenciación sin cultivo presenta importantes desafíos, debido a la complejidad de la matriz de la muestra, la escasa cantidad de ADN micobacteriano y la presencia de contaminantes, incluyendo material genético del huésped.
“Lo que queríamos en este estudio era intentar secuenciar el genoma de la bacteria la tuberculosis, Mycobacterium tuberculosis, no desde un cultivo, que es lo que se ha estado haciendo hasta ahora, sino directamente desde una muestra de diagnóstica”, explica a Gaceta Médica Iñaki Comas, director de la Unidad de Genómica de la Tuberculosis del IBV-CSIC.
Secuenciación directa
Con el objetivo de verificar esta hipótesis, el equipo del IBV-CSIC ha desarrollado una técnica que permite obtener y analizar el genoma de MTB directamente a partir de esputos, utilizando secuenciación directa, y luego compararlo con los genomas obtenidos de los respectivos cultivos.
“El principal obstáculo en el diagnóstico de la tuberculosis, especialmente cuando se trata de muestras de esputo, orina u otros fluidos, radica en la mínima presencia de la bacteria en la muestra“, explica Comas. “Estas muestras suelen contener una abundante cantidad de células humanas y otros microorganismos, como la microbiota presente en el esputo, mientras que la cantidad de la bacteria es extremadamente baja, por lo tanto, es fundamental desarrollar técnicas que permitan ‘capturar’ el genoma de Mycobacterium tuberculosis y eliminar el resto de contaminantes para poder analizarlo de manera efectiva”, asegura el investigador.
Para lograr este objetivo, en el estudio reunieron un conjunto de datos propio que abarca muestras de dos entornos con diferentes niveles de incidencia de tuberculosis (TB), carga de resistencias antimicrobianas (RAM) y coinfección por VIH. Posteriormente, secuenciaron con éxito 61 pares de muestras esputo-cultivo de alta calidad procedentes de Georgia y Mozambique, regiones con una carga de TB media y alta, respectivamente. Para las muestras de esputo, utilizaron un enfoque de secuenciación del genoma completo sin cultivo (dWGS) o enriquecido con cebo (eWGS), dependiendo de la cantidad de ADN de MTB presente. Además, realizaron una evaluación comparativa experimental para identificar las principales fuentes de variación genética artificial en los métodos sin cultivo.
El método también fue validado utilizando tres conjuntos de datos adicionales, provenientes de muestras de distintos países que habían sido publicadas previamente. Los resultados demostraron que la diversidad genética de la bacteria de la tuberculosis obtenida mediante secuenciación se conserva de manera consistente en las muestras de cultivo en todos los escenarios analizados.
“Existe una buena correlación entre lo que encontramos en los cultivos y lo que detectamos en las muestras de esputo, lo cual es positivo para el diagnóstico y confirma que los métodos basados en cultivo están funcionando correctamente”
“En general, existe una buena correlación entre lo que encontramos en los cultivos y lo que detectamos en las muestras de esputo, lo cual es positivo para el diagnóstico y confirma que los métodos basados en cultivo están funcionando correctamente”, afirma Comas, que aclara que “en algunas ocasiones pueden surgir diferencias, que principalmente se deben a que durante el proceso de cultivo ciertas poblaciones bacterianas se pierden, ya que hay un cuello de botella en el cultivo, es decir, algunas células de la bacteria no sobreviven o no logran crecer”. No obstante, también puede suceder que existan dos genotipos bacterianos y que en el cultivo uno predomine sobre el otro, ya que las bacterias de crecimiento más rápido tienden a dominar, mientras que las de crecimiento más lento pueden ser más difíciles de detectar, aunque en el esputo sí estén presentes.
Diagnóstico rápido
La principal desventaja de los cultivos radica en el lento crecimiento de MTB, lo que puede retrasar la obtención de resultados durante más de un mes. “El cultivo de Mycobacterium tuberculosis es un proceso lento, ya que el crecimiento bacteriano suele tardar entre dos y cuatro semanas y, además, obtener resultados sobre la resistencia a antibióticos puede tomar un periodo adicional de entre otras dos y cuatro semanas”, afirma Comas. “Esto plantea un problema importante, ya que si no se dispone de un método más rápido, los pacientes suelen recibir un tratamiento que podría no ser el más adecuado, lo que compromete la eficacia y el manejo de la enfermedad”, destaca.
En este sentido, un importante avance de este estudio es que ha sido pionero en lograr secuenciar con éxito 61 muestras de esputo, incluyendo aquellas con tan solo un uno por ciento de presencia de la bacteria. Sin embargo, Comas asegura que en la actualidad esta técnica no podría reemplazar los métodos actuales de diagnóstico, ya que “aún estamos un paso atrás de poder implementar esta técnica en la práctica clínica”. El experto asegura que “primero, es necesario continuar desarrollándola para que sea más accesible, fácil de usar y menos costosa, permitiendo que cualquier laboratorio pueda emplearla”.
“Primero, es necesario continuar desarrollándola para que sea más accesible, fácil de usar y menos costosa, permitiendo que cualquier laboratorio pueda emplearla”
En este sentido, la Unidad de Genómica de la Tuberculosis del IBV-CSIC está planificando los próximos pasos para adaptar este método a la práctica clínica.
Conocimiento completo del genoma de MTB
Conocer el genoma completo de la bacteria de la tuberculosis ofrece diversas ventajas más allá del diagnóstico. Una de ellas es la capacidad de identificar mutaciones que confieren resistencia a cualquier antibiótico. Tal y como explica Comas, “a diferencia de algunos test que solo detectan resistencia a antibióticos específicos, como la rifampicina o la isoniazida, nuestra técnica permite identificar resistencias a todos los antibióticos, incluso aquellos en los que no se sospechaba resistencia, ya que al conocer las regiones del genoma de la bacteria donde debemos buscar para detectar resistencias obtenemos un resultado mucho más completo”.
Además, al obtener el genoma completo también se puede comparar con el de las bacterias que infectan a otras personas, lo que permite realizar estudios epidemiológicos y rastrear si una persona ha estado en contacto con otra infectada. “De este modo, la técnica no solo nos ayuda a detectar resistencias, sino también a realizar estudios epidemiológicos, algo clave para el futuro”, asegura el investigador, que afirma que, al igual que sucedió con la COVID-19, esperan que estas técnicas de secuenciación masiva se vayan incorporando poco a poco en el manejo de la tuberculosis. “Si logramos implementarlas en la práctica clínica, podríamos obtener rápidamente información para diseñar tratamientos más personalizados, identificando el perfil exacto de resistencias de cada paciente y nos permitiría detectar casos de transmisión reciente, facilitando la investigación epidemiológica”, destaca Comas.
También te puede interesar…
